Setelah terjadinya jejas vaskular, kehilangan darah yang berlebihan, dikendalikan oleh suatu mekanisme. Selama proses ini, suatu serine protease, thrombin, dihasilkan secara lokal di tempat jejas. Thrombin memainkan peranan penting dalam peningkatan dan penghambatan pembekuan darah, dan juga proses-proses lainnya, seperti cell-signalling. Kegagalan dalam mengkoorinasi fungsi-fungsi ini dapat menyebabkan pendarahan maupun thrombosis. Struktur kristal thrombin, bersama dengan analisis biokimia mutan-mutan thrombin, telah memberikan penjelasan lebih tentang bagaimana fungsi dan aktivitas thrombin dimodulasi. Disebabkan peranan setnralnya dalam haemostasis, thrombin tetap menjadi suatu target terapi, karena terapi antithrombotik yang ada saat ini sangat bervariasi dan luas, dan penggunaannya memerlukan monitoring secara konstan untuk meminimalkan risiko haemorrhagic. Dalam review ini akan dibahas pengertian terbaru tentang bagaimana proteinase multifungsi ini berinteraksi dengan substratnya selama hemostasis.
 
Pembentukan Thrombin
Hemostasis merupakan suatu respon terhadap jejas vaskular. Kerusakan pembuluh menyebabkan reseptor permukaan sel, tissue factor, yang normalnya berada di lokasi ekstravaskular, menjadi terpapar dengan darah. Tissue factor berikatan dengan protease plasma, faktor VIIa. Begitu terikat dengan kompleks ini, faktor VIIa secara proteolitik mengaktivasi faktor X. Prekursor thrombin inaktif, prothrombin, bersirkulasi dalam plasma pada konsentrasi ~ 1.4 mM. Thrombin dihasilkan dengan aktivasi prothromin melalui faktor Xa. Pemutusan ikatan pertama terjadi pada R320, menghasilkan intermediate, meizothrombin dan kemudian pada R271, menghasilkan thrombin. Aktivasi proteolitik ini membebaskan fragmen F1+2, yang mengandung domain prothrombin Gla dan kringle. Di protrombin, modul-modul ini berperan untk menglokalisasi prothrombin pada permukaan membran platelet sebagai bagian dari aktivasi kompleks (atau prothrombinase) yang meliputi factor Va dan faktor Xa.
 
Begitu prothrombin diaktivasi, thrombin dapat terbebas dari kompleks prothrombinase dan kemudian bebas untuk menyerang substrat targetnya (gambar 1). Prothrombin berbeda dengan proteinase koagulasi teraktivasi lainnya dalam hal, sekali teraktivasi menjadi derivat serine proteinasenya, thrombin, ia akan kehilangan domain-domain yang penting untuk pengenalan awal/interaksi aktivasi. Kehilangan domain-domain ini membuat thrombin dapat teraktivasi dengan bebas, untuk bertemu, mengenali, memutuskan ikatan dan melepaskan diri dari berbagai substratenya. Kehilangan domain ini juga mengekspos crytic functional regions, yaitu active-site dan charged binding region, yang dinamakan exosite I dan II, yang merupakan penentu kritis dalam spesifisitas thrombin.
 
Struktur Thrombin
Struktur kristal thrombin telah diketahui sangat homolog dengan protease serin lainnya, seperti chymotrypsin. Suatu ciri umum dari enzim-enzim ini adalah adanya serine reaktif pada pembukaan active-site yang terlibat dalam serangan nukleofilik pada ikatan peptide target. Thrombin memiliki cirri tambahan yang menghasilkan spesifisitasnya, loops terekspos pada permukaan dan kantung-kantung bermuatan yang menyelubungi active-site. Loop -60 dan -γ membentuk kantong active-site yang mengandung serine katalitik. Loop-60 yang hidrofobik memiliki struktur yang keras, yang pada gilirannya akan diinduksi oleh dua proresidu yang berdekatan (P60b, P60c). Loop ini berinteraksi dengan residu hidrofobik pada sisi amino-terminal pada site pemutusan ikatan pada substrat thrombin. Semakin aktif g-loop hidrofilik berinteraksi dengan substrat residu carboxy-terminal pada ikatan target yang mudah diputuskan. Thrombin memiliki dua anion-binding exosites (I dan II) yang terdiri dari cluster residu basik yang terpapar permukaan. Exosite I berada di antara residue K36, H71, R73, R75, Y76, R77A, dan K109/110 dan exosite II termasuk residue R93, K236, K240, R101 dan R233. Kantung-kantung bermuatan ini berinteraksi secara spesifik dengan region bermuatan negatif pada kofaktor dan substrat thrombin.
 
Ciri penting thrombin lainnya adalah loop yang mengandung Na+-binding site. Ikatan suatu ion Natrium secara allosterik memodulasi thrombin. Begitu terikat, Na+ merombak fungsi thrombin, meningkatkan akses substrat-substrat ke active-site dan mendukung substrat prokoagulan tertentu misalnya fibrinogen dan PAR1) terhadap antikoagulan. Residu-residu ini yang secara energik berhubungan dengan allostery yang diinduksi Na+ adalah D189, E222, Y225. Akibat konsentrasi Na+ dalam darah (140 mM) site ini selalu terisi, dalam kondisi fisiologis normal. Mutan-mutan seperti E217K dan W215A/E217A menunjukkan penurunan aktivitas prokoagulan yang besar, tetapi mempertahankan fungsi antikoagulannya. Mutan-mutan seperti ini dapat mewakili antikoagulan terapeutik yang potensial.
 
Substrat Haemostatik Thrombin
Fungsi utama thrombin adalah mengkatalisasi konversi fibrinogen menjadi fibrin. Untuk ini dua fibrinopeptida pendek (FPA-16aa, FPB-14aa) diputuskan ikatannya masing-masing dari rantai Aa dan Bb. Pemutusan FPA terjadi terlebih dahulu untuk membentuk suatu monomen fibrin (disebut fibrin I), yang secara spontan berpolimerasi membentuk protofibris. Pemutusan ikatan FPB menghasilkan protofibril fibrin II yang mengalami agregasi lateral. Penumpukan fibrin lokal membentuk suatu meshwork yang menyelubungi platelet teragregasi, membentuk suatu clot yang stabil yang menutup tempat jejas vascular dan mencegah kehilangan darah.
 
Dalam proses pembentukan thrombin yang dinamis dalam darah, sebagian thrombin yang dihasilkan selama tahap awal koagulasi, memasuki loop aktivasi feedback. Ini mempengaruhi cascade koagulasi dengan mengaktivasi faktor V dan VIII. Begitu teraktivasi, faktor-faktor ini meningkatkan fungsi enzim-enzim yang terlibat dalam proses pembentukan thrombin yang lebih diperpanjang lagi. Thrombin mengaktivasi faktor V dan VIII dengan cara yang kurang lebih sama dengan pemutusan domain B sentral mereka. Di faktor V, R709. R1018, dan R1545 diputuskan ikatannya, menyisakan suatu fragmen domain A1-A2, yang secara ionik berikatan dengan domain A3-C1-C2.
 
Di faktor VIII, pemutusan yang berkaitan dengan analog adalah R373, R1649 dan R1689, menyisakan fragmen A1-A2 yang berikatan non-kovalen dengan fragmen A3-C1-C2. Thrombin secara proteolitik mengaktivasi faktor XIII, suatu reaksi prokoagulan yang ditingkatkan oleh kofaktornya, fibrin. Begitu thrombin memutuskan subunit faktor XIII A atas R37, suatu peptide aktivasi amino-terminal, dilepaskan. Hal ini mengekspos active-site residu C314 untuk menghasilkan transflutaminase aktif yang menstabilisasi fibril fibrin yang terdeposit, melalui cross-link covalent.
 
Selama hemostasis normal, mayoritas pembentukan thrombin terjadi pada permukaan platelet teraktivasi yang membentuk plug hemostatik utama. Platelet dapat diaktivasi oleh sejumlah agonis, termasuk thrombin, yang secara spesifik mengaktivasi platelet dan berinteraksi serta memutuskan ikatan protease activated receptor (PAR). Pemutusan reseptor PAR terjadi pada R41, melepaskan suatu ligand intramolucular yang berkaitan dengan salah satu loop ekstraselularnya yang menyebabkan signal yang diinduksi receptor.
 
Suatu mekanisme aktivasi platelet yang kedua melibatkan proteolisis glikoprotein (GP)v, bagian dari kompleks GpIb-IX-V pada permukaan platelet yang bersirkulasi. Ini kemudian akan menghasilkan platelet hiper-responsif. Thrombin juga dapat secara proteolitik mengaktivasi faktor XI (suatu serine protease lain dalam cascade pembekuan darah) di bawah kondisi yang membutuhkan anion seperti dextran sulfat. Tetapi dengan adanya platelet teraktivasi, suatu proses aktivasi fisiologis yang lebih mungkin, terjadi, yang melibatkan GpIba sebagai suatu kofaktor dalam reaksi ini, yang kemudian menghasilkan pemutusan ikatan faktor XI dan R369.
 
Selain aktivitas prokoagulan yang disebutkan di atas, thrombin juga berperan dalam interaksi/reaksi yang menghilangkan fungsi antikoagulan. Thrombin yang dibentuk berdekatan dengan sel endothelial yang melapisi lumen pembuluh, dapat berikatan pada kofaktornya, dalam hal ini thrombomodulin, pada permukaan sel-sel ini dalam kompleks afinitas yang tinggi. Begitu terikat dengan kompleks thrombin-thrombomodulin, spesifisitas substrat thrombin dialihkan dari reaksi prokoagulan menjadi antikoagulan. Reaksi prokoagulasi dihalangi (sebagian karena penempatan exosite I oleh thrombomodulin) dan aktivitas protein C meningkat berkali-kali lipat. Hal ini terjadi melalui pemutusan ikatan protein C pada R169 dan kemudian pelepasan suatu peptide aktivasi. Protein C teraktivasi adalah suatu protease antikoagulan yang menghambat fungsi faktor V dan VIIIa, dan kemudian mengurangi pembentukan thrombin lebih lanjut. Kompleks thrombin-thrombomodulin juga mengaktivasi carboxypeptida, thrombin-activated fibrinolisis inhibitor (TAFI) dengan protelolis specifik pada R92. Kecepatan aktivasi ini 1000x lebih besar dibanding dengan thrombin sendiri. TAFI teraktivasi menstabilkan clot fibrin melalui penghilangan residu lysine terminal dari fibrin secara proteolitik. Potongan asam amino ini meruntuhkan binding site untuk protein fibrinolitik yang menon-stabilkan jaringan fibrin
 
Secara fisiologis, waktu paruh thrombin dalam plasma adalah ~ 10-15 detik, sebagian besar melalui penghambatan oleh serpin plasma, antithrombin. Penghambatan thrombin oleh antithrombin bersifat reversibel. Tetapi dengan pemutusan ikatan r393 pertama dari loop ?ait?yang reaktif dari antithrombin, thrombin menjadi terkunci dalam suatu kompleks irreversible dan kemudian dibersihkan dari sirkulasi. Reaksi ini ditingkatkan oleh kofaktor glycosaminoglycan heparin dan heparin sulfat yang menyamai reaktannya. Dalam suatu proses yang serupa, yang melibatkan pemutusan serpin lainnya dari L444, heparin kofaktor II (dengan adanya glycosaminoglycans), penghambatan thromin dapat ditingkatkan lebih jauh lagi.
 
Interaksi thrombin multiple yang disebutkan di atas menimbulkan pertanyaan tentang bagaimana aktivitas thrombin secara spesifik dikoordinasi selama hemostasis untuk menghasilkan suatu plug hemostasis hanya pada tempat jejas dan tidak ke keseluruhan endothelium. Penempatan exosite permukaan (I dan II) oleh kofaktor-kofaktor di atas untuk banyak reaksinya memberikan suatu mekanisme, yang dapat mengarahkan aktivitasnya. Exosite-exosite ini berinteraksi dengan kofaktor-kofaktor untuk meningkatkan berbagai reaksi thrombin. Karena kofaktor memiliki suatu pengaruh yang besar terhadap fungsi thrombin, arah yang diambil thrombin menjadi lebih dikendalikan oleh avaibilitas oleh kofaktornya, dan dengan demikian kompetisi kofaktor-kofaktor ini terhadap exositenya masing-masing.
 
Pendekatan farmasetika terhadap inhibisi Thrombin
Kompleksitas sistem koagulasi menghasilkan sejumlah besar strategi terapeutik yang dapat dipakai untuk pengembangan obat-obat antikoagulan. Sekarang ini, antikoagulan jangka panjang sebagian besar dicapai dengan antikoagulan oral seperti warfarin. Untuk pengobatan jangka pendek, heparin dan low mw heparin dapat digunakan. Warfarin mengurangi kadar dari banyak faktor pembekuan (menginduksi faktor VII, faktor IX, faktor X, dan prothrombin). Heparin secara tidak langsung (dengan meningkatkan aksi antithrombin) menghambat faktor Xa dan thrombin. Suatu panel obat-obat baru yang potensial telah didesain untuk menargetkan tahapan-tahapan spesifik pada sistem koagulasi. Dua obat yang menargetkan thrombin adalah ximelagatran (suatu prodrug dari melagatran) dan dabigatran (prodrugnya dalah dabigatran etexilate). Walaupun ada hasil-hasil yang sangat baik dari uji-uji klinis dalam hal antikoagulan yang telah memvalidasi penargetan thrombin untuk maksud ini, ximelagatran menyebabkan toksisitas hati dan tidak cocok untuk terapi jangka panjang. Meskipun ada keterbatasan ini, hanya merupakan masalah waktu sebelum suatu inhibitor thrombin langsung, yang efektif dan memiliki toksisitas rendah, tersedia untuk penggunaan klinis.
 
Sumber: Clinical Laboratory International, Juni 2006